HRM(High Resolution Melting，高分辨率溶解曲線)，作為上成熟的點突變掃描與檢測技術(shù)，在人類疾病相關(guān)基因鑒定、植物誘變育種基因突變檢測及基因分型等多個領域都得到了廣泛的應用?，F(xiàn)在我們就重點關(guān)注一下HRM技術(shù)在植物育種中的具體應用。

    現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領域中，分子遺傳育種在植物育種中發(fā)揮著越來越大的作用。HRM之所以作為分子育種中常用的突變檢測、基因分型技術(shù)，是由于HRM不受突變堿基位點和種類的局限，無需使用序列特異性探針，具有高靈敏度、操作簡單、高通量、成本低等優(yōu)點。

HRM在植物誘變?nèi)后w中的突變掃描

    為了獲得種質(zhì)資源，常采用物理誘變、化學誘變等技術(shù)處理植物樣本，而這些誘變技術(shù)通常會導致點突變、小片段插入缺失突變等。在獲得誘變?nèi)后w后，針對特定基因設計特異性引物，采用HRM技術(shù)高通量篩選誘變?nèi)后w，獲得突變個體。由于HRM技術(shù)速度快、成本低、通量高，所以非常適合植物誘變?nèi)后w的點突變掃描。

    在異源六倍體小麥中，Dong等*次應用HRM分析EMS(Ethylmethane Sulfonate，甲基磺酸乙酯)誘發(fā)的點突變?nèi)后w，實現(xiàn)同時掃描小麥SSII-A、SSII-B和SSII-D。他們在SSII-A、SSII-B和SSII-D的C末端保守區(qū)域上相似性很高的一段序列(532bp含17個SNPs)設計引物，分幾個片段(長度約100～250bp)可同時擴增三個基因，然后對小麥農(nóng)家種Ventura的EMS誘變?nèi)后w進行HRM分析。對140個樣品的未知突變進行掃描，片段ABD6-1由于其G+C含量高(63.72%)、固有的SNP較多(5 SNIPs)及二級結(jié)構(gòu)造成的影響，有15個樣品出現(xiàn)差異的熔解峰，結(jié)合其他手段進一步證實該群體擴增出的ABD6-1片段有8個突變體，而HRM分析掃描出其中的7個；片段ABD2-9中有6個突變體而HRM掃描出其中的5個；片段ABD12-22包含的6個突變體均被HRM掃描出?？梢?，HRM掃描未知突變的靈敏度較高(83.3%～100%)，且常受到G+C含量、二級結(jié)構(gòu)、DNA樣品純度等因素的影響。

HRM在基因分型中的應用

    目前主流高通量SNP基因分型方法包括SNP芯片分型技術(shù)、KASP（Kompetitive Allele Specific PCR）競爭性等位基因特異性PCR技術(shù)等，特別適合于需要篩選多個SNP位點且群體量大的樣本群體。除此之外，HRM分析應該是僅次于以上兩種高通量篩選技術(shù)的*選擇。HRM分析應用于植物基因分型，不需要特異性序列探針，在PCR反應后直接對DNA雙鏈逐漸升溫變性熔解，然后通過光學檢測系統(tǒng)采集熒光信號變化并繪制溶解曲線，軟件會根據(jù)曲線準確將野生型、雜合型、純合型樣本區(qū)分開來。（如圖）

      HRM實驗的成功，除了周密的實驗設計外，一款合適的儀器也是獲得準確實驗數(shù)據(jù)*的保證。根據(jù)HRM實驗原理，對于儀器來講，的溫度均一性和高數(shù)據(jù)采集密度是保障實驗成功的核心所在。由于點突變引起的解鏈溫度差異很小，一般要求儀器的溫度均一性小于0.2度才能檢測出突變引起的溫度差異，所以儀器的溫度均一性越好，儀器的檢測靈敏度就會越高。此外，儀器需要具備高的數(shù)據(jù)采集密度，才能實時地記錄整個過程的溫度變化。

    瑞士Roche LightCycler 480Ⅱ推出的實時熒光定量PCR系統(tǒng)，以其的性能深受廣大科研工作者的青睞。對于HRM實驗，LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR系統(tǒng)除了具備以上兩點要求外，zui大的優(yōu)點在于速度非?？烨也僮骱啽?，專業(yè)的軟件分析功能更有助于突變個體的鑒別，支持一鍵數(shù)據(jù)導出，方便實用，是實驗室HRM實驗的*選擇！